Adaptación del virus de la hepatitis A a silenciamiento celular

La adaptación del Virus de la Hepatitis A al silenciamiento celular implica ajustes en el uso de codones y conduce a la selección de poblaciones vitales con cápsidas alteradas.

El Virus de la Hepatitis A (HAV) posee un uso de codones altamente deoptimizado, un IRES muy ineficiente y es incapaz de inhibir la síntesis proteica celular. Como consecuencia la traducción de su genoma es muy lenta.

Hemos adaptado la cepa salvaje del HAV a replicar a distintos niveles de silenciamiento celular (shut-off) inducido artificialmente mediante la utilización de diferentes concentraciones de Actinomicina D (AMD). La AMD inhibe específicamente la síntesis de mRNA celular sin afectar la transcripción vírica. Con este procedimiento se han seleccionado 10 poblaciones distintas que han sido caracterizadas a nivel genómico, antigénico y biológico. Así de forma genérica se ha detectado una re-deoptimización del uso de codones de la región codificante de la cápside durante la adaptación al silenciamiento celular, la cual ha inducido un cambio conformacional de la misma con una menor exposición del epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal (MAb) K24F2 y una mayor exposición de los epitopos reconocidos por los MAbs K34C8 y H7C27. A su vez estos cambios dan lugar a cápsides mucho más susceptibles a condiciones extremas de temperatura y pH a diferencia de la población parental que es altamente resistente. Por otro lado estos cambios conformacionales se asocian a cambios en el proceso de entrada celular. Así las dos poblaciones adaptadas a condiciones de alto silenciamiento celular exhiben tiempos de desencapsidación muy cortos de tan sólo 4 y 8 horas para la desencapsidación del 50% de las partículas (UT₅₀) comparado con las 18 horas de la población parental del HAV. Como consecuencia estas poblaciones producen calvas de gran diámetro (0.70 cm) comparado con la población parental (0.20 cm).     

Estas poblaciones, pues, abren nuevas perspectivas para el estudio del ciclo biológico del HAV, gracias a su fenotipo de más rápida replicación, como son los procesos de entrada y salida celular. Ello puede ser de gran interés para estudiar en profundidad el mecanismo de salida por exocitosis del HAV, descrito recientemente por el grupo de Stanley Lemon de la Universidad de Carolina del Norte, y que representa un cambio de paradigma puesto que genera cápsides envueltas de un picornavirus.

M. Isabel Costafreda, Francisco J.Pérez-Rodriguez, Lucía D’Andrea, Susana Guix, Enric Ribes,  Albert Bosch, Rosa M. Pintó. Hepatitis A VirusAdaptation to Cellular Shutoff Is Driven by Dynamic Adjustments ofCodon Usage and Results in the Selection of Populations withAltered Capsids. Journal of Virology 2014, 88: 5029–5041.

Detección y cuantificación simultánea de virus

DESARROLLO DE UNA ONE-STEP RT-PCR CUANTITATIVA CUÁDRUPLEX PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN SIMULTÁNEA DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A, NOROVIRUS GI Y GII Y MENGOVIRUS

El virus de la Hepatitis A (HAV) y los Norovirus genogrupo I (NoV GI) y genogrupo II (NoV GII) son importantes agentes causantes de enfermedades de transmisión por  agua y alimentos.

En este contexto, se hace necesaria la disponibilidad de metodologías para una precisa detección y cuantificación de estos virus tanto en aguas como en distintas matrices alimentarias. En el año 2004, el Comité Europeo de Normalización (CEN) creó un grupo de asesoramiento técnico (CEN/TC275/WG6/TAG4) para el desarrollo de métodos estandarizados de extracción de virus a partir de distintas matrices alimentarias y análisis por real-time RT-PCR (monoplex) para la detección cualitativa y cuantitativa tanto de HAV como de NoV. Dichos métodos han devenido en la actualidad como procedimientos ISO (CEN/ISO TS 15216-1; CEN/ISO TS 15216-2). En dichos protocolos se utiliza Mengovirus como virus control para la determinación de la eficiencia del proceso de extracción de los virus diana a partir de las distintas matrices alimentarias y de su RNA. Además de dicho control, se incluyen también transcritos correspondientes a cada uno de los virus como controles externos para la determinación de la eficiencia de la reacción de retrotranscripción. Ambos controles funcionan a modo de control de calidad del proceso experimental y al mismo tiempo ofrecen la posibilidad de utilizar los valores tanto de la eficiencia de extracción como de la eficiencia de la reacción de retrotranscripción para corregir los datos crudos de cuantificación de los virus diana y obtener de esta manera una cuantificación más precisa de la carga vírica.

Hasta la fecha, no se han descrito ensayos de RT-PCR cuantitativa multiplex para la detección simultánea de HAV y NoV que incluyan controles del proceso de extracción ni controles externos. En este estudio se presenta un ensayo de RT-PCR cuantitativa en formato cuádruplex para la detección y cuantificación simultánea de HAV, NoV GI y NoV GII, juntamente con el virus Mengo, utilizado como virus control de proceso. Además de dicho control, y de manera análoga a los protocolos monoplex desarrollados por el CEN, también se incluyen controles externos para cada uno de los virus diana. El ensayo cuádruplex presentado fue  validado en comparación a los correspondientes ensayos en formato monoplex desarrollados por el CEN.

Tras la optimización del ensayo cuádruplex, los resultados obtenidos al ensayar diluciones seriadas tanto de los distintos RNAs víricos como de plásmidos con las respectivas secuencias diana clonadas fueron muy similares en ambos formatos monoplex y cuádruplex. La diferencia media de Cqs entre ambos formatos fue de 0.14, 0.08 y 0.83 para HAV, NoV GI y NoV GII, respectivamente, en el caso de los plásmidos; y de 0.90, 0.28 y 0.44, en el caso de los RNAs víricos. En cuanto a los límites de detección obtenidos en el ensayo cuádruplex para HAV, NoV GI y NoV GII, éstos fueron de 491, 23 y 33 copias por reacción, respectivamente. En el caso de NoV GII el límite de detección resultó similar al del ensayo en formato monoplex, mientras que en el caso de HAV y NoV GI los límites de detección obtenidos fueron 1-log superiores a los de los respectivos ensayos monoplex. Para evaluar la implicación de estas pérdidas en límite de detección teórico, se procedió a analizar muestras de agua y marisco naturalmente contaminadas usando ambos tipos de ensayos. En general, se observó una buena correlación entre los títulos de copias genómicas obtenidas con ambos ensayos. En comparación con los ensayos en formato monoplex, el ensayo cuádruplex mostró unas diferencias de título medias de 0.32 log para HAV, 0.37 log para NoV GI y 0.51 log para NoV GII.

En definitiva, a pesar de la ligera pérdida de sensibilidad respecto a los ensayos en formato monoplex, el ensayo cuádruplex presentado resulta una alternativa útil a modo de screening inicial de muestras de marisco y agua, debido a la reducción que supone tanto a nivel de tiempo empleado para su desarrollo como a nivel de costes.

Fuentes C, Guix S, Pérez-Rodriguez FJ, Fuster N, Carol M, Pintó RM, Bosch A. Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water. Food Microbiol. 2014 Jun;40:55-63.